El museo de la Real Colegiata de San Isidoro de León es uno de los más visitados en la provincia de León y contiene una de las mejores colecciones de arte románico de Europa.
El pórtico occidental de la primitiva iglesia alberga el Panteón Real, cuyas pinturas están consideradas como la capilla Sixtina del románico. En esta construcción de planta cuadrada de tres naves reposan los reyes de León y hasta 33 miembros de la Corte Leonesa. Data de antes de 1063, y sus murales son probablemente anteriores a 1149.
El Panteón tiene capiteles de tema vegetal, con figuras zoomórficas e historiados. Las seis bóvedas están totalmente decoradas con pinturas murales realizadas por autores desconocidos al temple sobre estuco blanco. Las escenas se enmarcan por orlas decorativas. Destacan la Anunciación a los Pastores, escena campestre donde el ángel anuncia a los pastores el Nacimiento de Cristo, y el afamado Calendario Agrícola, que se desarrolla en el intradós de un arco y retrata la vida real de los lugareños de la época, mes a mes, destacando la actividad principal de cada período. Merece mención en la bóveda central del Panteón, el Cristo Pantocrátor o Creador del Universo.
En la capilla de los Vaca se encuentran expuestos el gallo-veleta original de la torre, realizado en cobre plomado recubierto de oro, y una campana fundida en 1086, considerada la más antigua de España.
En la sala del Tesoro se guardan impresionantes joyas medievales. Solían tratarse de objetos de ajuar eclesiástico, como manteles de altar o vestiduras de los religiosos, reliquias, libros, documentos, así como las ofrendas y las reliquias. Si bien el Tesoro menguó tras las desamortizaciones e incautaciones del siglo XIX, aún conserva muchas y muy valiosas piezas. Destaca, por ejemplo, el Pendón de Baeza: un estandarte de tafetán carmesí sobre el que se bordó la figura de San Isidoro a caballo, el escudo real y una nube de la que sale una mano con una espada y una estrella, alusivas a Santiago apóstol; representa la intervención que, según la leyenda, San Isidoro tuvo en el cerco de Baeza (1147). También el Arca de Reliquias de San Isidoro, destinada a guardar las reliquias del Doctor Hispaniae, y el Cáliz de Doña Urraca, donación de la hija de Fernando I: está formado por dos copas de ágata romano-orientales, que en el siglo XI se unieron y se forraron de oro, decorándolas con piedras, perlas y un camafeo.
Finalmente, la biblioteca cuenta con cerca de 400 incunables y 1.055 libros antiguos. Custodia 155 códices, como los Morales de Job (951), la Biblia visigótico-mozárabe (960), la Biblia románica (1162), Martirologio y Necrologio (siglo XII), Obras de Santo Martino (siglo XII), el Chronicon Mundi, Crónica de España de don Lucas de Tuy (siglo XIII), además de misales, breviarios, Obras de los Padres, Vida y Milagros de San Isidoro, teología, derecho canónico, cantorales, ceremoniales, sermonarios, inventarios y estatutos capitulares.